用户文章∣脂质代谢组+单细胞转录组揭示骨骼肌中脂肪浸润的细胞特征和脂质动力学

标题：Single-cell RNA sequencing and lipidomics reveal cell and lipid dynamics of fat infiltration in skeletal muscle发表日期：2020年11月发表杂志：Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle影响因子：12.063研究机构：浙江大学动科院技术手段：10X Genomics单细胞转录组测序、脂质代谢组学、转录组测序摘要

在骨骼肌中，肌内脂肪浸润是衰老以及肌营养不良症等几种肌病的共同特征，并与肌肉功能障碍和胰岛素抵抗等密切相关。而在畜禽肉类生产中，肌内脂肪沉积直接影响着肉的品质（如大理石纹、嫩度和多汁性等）。但是，肌内脂肪沉积过程中的细胞起源、调控机制以及对肌肉脂质代谢重塑的影响仍然不清楚。因此，解析肌内脂肪沉积的细胞来源、调节机制及其对骨骼肌脂质代谢重塑的影响，一方面为人类骨骼肌脂肪浸润相关性疾病的预防和治疗提供一定的借鉴，另一方面为通过调控畜禽肉类生产中肌内脂肪沉积进而改善肉的品质提供一定的指导。

结果

{

通过scRNA-seq在甘油损伤的骨骼肌中鉴定出的细胞群

}

为了预测肌肉再生过程中浸润的脂肪细胞的起源，作者检索了一系列被确定为脂肪生成相关和脂肪生成相关基因的基因的表达。前脂肪细胞富集基因（Cd38、Zfp423、Cd34和Ly6a）、脂肪生成主调节因子（Cebpb和Pparg）、晚期脂肪生成基因（Fabp4）和脂肪生成基因（Fasn、Acsl1、Agpat2、Lpin1和Scd1）在成纤维细胞/FAPs 和髓源性细胞簇中广泛表达。增殖基因（Mki67和Cenpf）在部分髓源性细胞簇、NK细胞和FAP中表现出更高的表达水平。在所有簇中几乎没有成熟脂肪细胞分化标志物（Adipoq、Plin1、Slc2a4、Ppargc1a、Retn和Lep）的表达。这些脂肪生成相关和脂肪生成相关的基因表达模式表明，成纤维细胞/FAPs 和骨髓来源的细胞簇都可能参与GLY诱导的肌肉再生过程中的脂肪沉积。

图1 scRNA-seq在GLY损伤骨骼肌中的细胞群

{细胞聚类和拟时序分析确定了成纤维细胞/成纤维细胞/脂肪祖细胞的转录动力学}

成纤维细胞/FAP进一个步聚类后得到6个亚群，亚群0和3表达相对较高水平的Ly6a和 FAP 的单一基因标记Pdgfra。亚群 1 和 2 表达相对较高水平的肌成纤维细胞标志物（Myl9和Tagln）。亚簇 2 中的细胞具有增殖性，因为它们表达更高水平的Mki67和Cenpf。亚群4 中的大多数细胞表达激活的FAP标记 ( Osr1 )。亚群5以肌腱细胞标志物（Scx和Tnmd）的表达为标志。早期成脂基因（Dlk1和Klf4）在 亚群3 中的表达水平相对较高。较晚的脂肪生成基因（Cebpa和Pparg）在亚群0中的表达水平相对较高。拟时间轨迹分析用于分析成纤维细胞/FAPs的连续细胞状态的进展，并揭示了在轨迹中表达不同水平标记基因的有序细胞。拟时序分析将大部分成纤维细胞/FAP排列成一个主要轨迹，有5个分叉和 11个阶段。亚群3的GO分析显示细胞外基质组织和胶原原纤维组织明显富集，而不涉及脂肪生成相关途径。这与之前的报道一致，即在 GLY 损伤模型中基底层被破坏，并且在 GLY 注射后至少7天检测到异位脂肪细胞浸润。

图2 细胞亚群聚类和拟时序轨迹分析鉴定成纤维细胞/ FAPs

来自 GLY 损伤肌肉的成纤维细胞/FAP 在与胶原蛋白（ Col5a1、Col3a1和Cthrc1）和细胞外基质（Postn）发育相关的基因中的表达明显更高。线粒体相关（mt-Co3、mt-Atp6和mt-Co2）和核糖体相关（Rpl23a-ps3、Rpl10-ps3、Rps27rt、Rpl9-ps6、Rpl18-ps3和Rpl13-ps3）基因在GLY 损伤的肌肉富集。值得注意的是， Col3a1的表达水平，GLY 损伤肌肉中的Col1a1和Col1a2高于 CTX 损伤肌肉，表明胶原蛋白发育在 5 DPI 时 GLY 损伤肌肉中起更重要的作用。

{细胞亚群聚类和拟时序轨迹分析鉴定骨髓来源细胞}

对集群髓源性细胞进行了t-SNE分析，观察到存在10个亚群，并根据髓源性细胞标记基因（Cd68、Clec12a和Acp5）、M1 巨噬细胞（M1 MΦ，Fabp4和Pf4），M2 MΦ（Cxcl3和Ccl6），Il7r + MΦ（Il7r) 和单核细胞 ( Csf1r和Adgre1 )。亚群之间表达变化最大的 10 个基因的可视化显示了10个亚群的不同转录过程。一些骨髓来源的细胞表达这些富含前脂肪细胞的基因（Dlk1、Zfp423、Pdgfra和Cd34）。亚群Mye0和Mye9中的骨髓细胞表达相对较高水平的Cd38和Ly6a。成脂分化调节因子（Cebpb、Cebpa和Pparg）在 Mye2、Mye4 和 Mye5 亚群中表达。亚群Mye4在表达增殖标记Mki67、Cenpf和Top2a方面也很活跃。此外，脂质合成标记（Fabp4）、周脂标记（Plin2）、脂蛋白脂肪酶（Lpl）和磷脂生物合成酶（Agpat2）主要在亚群Mye2、Mye4和Mye5中表达。Mye0、Mye1、Mye2、Mye4、Mye5、Mye6 和 Mye8亚群中的一些骨髓衍生细胞也表达了其他脂质代谢相关基因（Fasn、Acsl、Gpd1、Lpin1和Scd1）。基于小鼠细胞周期标志物的细胞周期分析显示，91.9%的骨髓来源细胞是G 1期细胞，而7.8%的骨髓来源细胞是G2 /M 期细胞，大部分G 2 /M 期细胞属于Mye4亚簇。

在分化的 Pdgfra +（绿色圆圈）和 Pdgfra -（红色圆圈）细胞中都检测到了脂滴。特别是在 Pdgfra - /Cd68 +（橙色圆圈）细胞中也检测到了脂滴。结果表明，少数髓源性细胞亚群可能参与 GLY 损伤肌肉中的脂质沉积并表现出活跃的脂质代谢，特别是在可能来自增殖细胞的 Mye2、Mye4 和 Mye5 亚群中在子集群 Mye4 中。拟时间细胞的排序将大部分骨髓来源的细胞排列成一个主要的轨迹，具有三个小分叉和六个阶段。位于轨迹初始阶段的细胞对应于亚群Mye4的部分，如增殖标记基因（Mki67和Cenpf）的表达所示。沿着伪时间轨迹的这七个亚群中受影响显着的基因被分配到四个基因模块中。几个髓源性细胞亚群在 GLY 诱导的肌肉再生过程中通过脂质沉积或细胞因子产生参与脂肪浸润和脂质代谢。

图3 细胞亚群聚类和拟时序轨迹分析鉴定骨髓来源细胞

{甘油诱导的肌内脂肪浸润影响参与脂质代谢的基因表达}

为了绘制IMAT浸润在骨骼肌中的转录变化，我们在 14 DPI 对注射 GLY 和 NACL 的骨骼肌进行了 RNA-seq。结果共发现2168个DEG，其中1847个上调和321个基因下调。GLY诱导的脂肪浸润显着增加了这些与脂肪生成相关的基因（Cebpa、Add1、Pparg、Lpl、Fabp4、Lep和Adipoq）的表达。值得注意的是，编码4型葡萄糖转运蛋白的Slc2a4的表达水平在注射 GLY 的肌肉中被下调。

使用 KEGG功能富集分析揭示了 ECM- 受体相互作用通路、PI3K-AKT 信号通路、造血细胞分化和趋化因子信号通路的显着富集。服务于 PI3K-AKT 信号通路下游的脂质代谢调节基因（Prkaa1、Stk11、Mtor和Foxo1）的表达在高 IMAT 肌肉中也增加。STK11的蛋白质水平显着增加，与注射GLY的肌肉中FAPB4水平的增加一致。我们的脂质组学分析揭示了甘油脂、甘油磷脂和鞘脂的显着变化。TPM 分析显示，在脂肪浸润的肌肉和对照组之间，参与甘油脂、甘油磷脂和鞘脂代谢的基因存在显着差异。此外，不饱和脂肪酸相关基因的生物合成也受到高 IMAT 含量的影响。

这些结果表明，GLY 诱导的脂肪浸润同时改变了参与 ECM、细胞迁移和细胞粘附以及脂质和脂肪酸代谢途径的基因的表达水平。

图4 GLY诱导的IMAT浸润改变了骨骼肌中脂质组成

{冷暴露改变了肌内脂肪浸润的胫骨前肌中的脂肪酸组成}

为了检查冷暴露在脂肪浸润的骨骼肌中的短期影响，作者将先前注射 GLY 并在室温（22°C）或冷条件（4°C）下进行IMAT浸润的小鼠维持3天并密切观察检查身体和组织重量。结果发现冷暴露导致体重减轻以及脂肪组织质量（BAT、腹股沟白色脂肪组织和附睾白色脂肪组织）和 TA 的损失。H&E 染色显示，与RT个体相比，冷暴露小鼠的 IMAT细胞数明显减少。数据表明，在 GLY 诱导的 IMAT 浸润模型中，3 天的冷暴露降低了体重和脂肪量，诱导了 GLY 诱导的 IMAT 的 BAT 标记基因的表达，影响了细胞脂质和能量代谢，并减少了脂肪细胞浸润。

图5 冷暴露改变了IMAT浸润小鼠的脂肪酸组成

结论

本研究通过甘油（GLY）注射生成了高IMAT浸润的骨骼肌模型。在注射后（DPI）5天对GLY损伤的骨骼肌通过单细胞转录组测序鉴定不同细胞来源和动力学特征。对14 DPI（冷处理则为17 DPI）的IMAT浸润骨骼肌进行脂质组学和转录组测序，以分析脂质组成和基因表达水平的变化。

研究发现，在GLY损伤的骨骼肌中发现了9个不同细胞亚群，包括髓样来源细胞（52.13％），成纤维细胞/纤维细胞/脂肪形成祖细胞（FAPs）（23.24％）和骨骼肌干细胞（2.02％）。拟时序轨迹分析显示成纤维细胞/FAPs中有6个亚群，而骨髓来源的细胞中有10个亚群。表达成脂细胞富集基因的髓系细胞亚群和Pdgfra/Cd68+细胞在成脂诱导后表明其成脂潜力。

脂质组学分析显示，整体脂质类别组成和脂质分布变化了显著差异的变化。转录组测序在GLY损伤骨骼肌模型中揭示了1847个上调基因和321个下调基因，并且与脂质代谢相关的途径（如甘油脂途径和甘油磷脂途径）发生了显著变化。

值得注意的是，短期寒冷环境暴露下通过直接影响脂质代谢途径（如PI3K–AKT和MAPK信号传导途径）改变了脂肪浸润肌肉中的脂肪酸组成。

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